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常見微生物菌種衰退原因及預(yù)防

發(fā)布時間:2019-09-10    瀏覽次數(shù):5880

微生物長期受到外界的影響,遺傳性狀必然發(fā)生某些變異。正是由于變異的存在才使得生物向前進(jìn)化。然而由于突變的存在,菌種在培養(yǎng)或保藏過程中,可能會出現(xiàn)某些優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記丟失、典型特征改變等現(xiàn)象,稱為菌種衰退。比如蘇云金芽孢桿菌由于菌種衰退,導(dǎo)致其新生的菌體芽孢和伴孢晶體都比較?。槐2氐纳抽T氏菌鞭毛抗原丟失,導(dǎo)致H多價血清不凝固等。

1. 菌種衰退原因

菌種衰退的根本原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變,則表現(xiàn)為產(chǎn)量下降;如果控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變,則產(chǎn)生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過程中會發(fā)生自發(fā)突變。雖然自發(fā)突變的幾率很低(一般為10-6~10-9),尤其是對于某一特定基因來說,突變頻率更低。但是由于微生物具有極高的代謝繁殖能力,隨著傳代次數(shù)增加,衰退細(xì)胞的數(shù)目就會不斷增加,在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢,最終成為一株衰退了的菌株。此外,菌種衰退還有以下幾種原因:

1)表型延遲造成菌種衰退

表型延遲現(xiàn)象也會造成菌種衰退。如,在誘變育種過程中,經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)某菌株初篩時產(chǎn)量較高,進(jìn)行復(fù)篩時產(chǎn)量卻下降了。

2)質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退

質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退的情況在抗生素生產(chǎn)中較多,不少抗生素的合成是受質(zhì)粒控制的。當(dāng)菌株細(xì)胞由于自發(fā)突變或外界條件影響(如高溫),致使控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或者核內(nèi)DNA和質(zhì)粒復(fù)制不一致,即DNA復(fù)制速度超過質(zhì)粒,經(jīng)多次傳代后,某些細(xì)胞中就不具有對產(chǎn)量起決定作用的質(zhì)粒,這類細(xì)胞數(shù)量不斷提高達(dá)到優(yōu)勢,則菌種表現(xiàn)為衰退。

3)連續(xù)傳代

連續(xù)傳代是加速菌種衰退的一個重要原因。一方面,傳代次數(shù)越多,發(fā)生自發(fā)突變(尤其是負(fù)突變)的幾率越高;另一方面,傳代次數(shù)越多,群體中個別的衰退型細(xì)胞數(shù)量增加并占據(jù)優(yōu)勢越快,致使群體表型出現(xiàn)衰退。

4)不適宜的培養(yǎng)和保藏條件

不適宜的培養(yǎng)和保藏條件是加速菌種衰退的另一個重要原因。不良的培養(yǎng)條件如營養(yǎng)成分、溫度、濕度、pH值、通氣量等和保藏條件如營養(yǎng)、含水量、溫度、氧氣等,不僅會誘發(fā)衰退型細(xì)胞的出現(xiàn),還會促進(jìn)衰退細(xì)胞迅速繁殖,在數(shù)量上大大超過正常細(xì)胞,造成菌種衰退。

2. 防止菌種衰退措施

采用已衰退菌種進(jìn)行生產(chǎn)會影響生產(chǎn)效率,而把已衰退菌種作為陽性菌株進(jìn)行檢驗,則會影響檢驗正確率。既然變異是不可避免的,那么我們應(yīng)該如果避免菌種衰退呢?

1)控制傳代次數(shù)

盡量避免不必要的移種和傳代,把必要的傳代減少到最低的水平以減少突變幾率。傳代次數(shù)越多,產(chǎn)生突變的幾率就越大,菌種發(fā)生衰退的機(jī)會就越高。在實驗室檢驗或者是生產(chǎn)實際中,應(yīng)嚴(yán)格控制傳代次數(shù)。中國藥典當(dāng)中規(guī)定,培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代,以防止菌株因傳代次數(shù)過多引起衰退影響檢驗。

2)利用不同類型細(xì)胞進(jìn)行接種傳代

放線菌,霉菌用菌絲進(jìn)行移種比分生孢子容易衰退,因菌絲是對核且有異核存在,所以移種霉菌適宜采用孢子。

3)良好的培養(yǎng)條件

不良的培養(yǎng)條件會衰退細(xì)胞的出現(xiàn),因此采用適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行菌種培養(yǎng),以減少衰退幾率

4)采用有效的菌種保藏方法

根據(jù)保存時間的長短,選擇適宜的保存方法。


  • 傳代培養(yǎng)法:復(fù)蘇后的第一代放于4℃冰箱或室溫保存,定期傳代培養(yǎng)。保藏時間依微生物種類而定。如,芽孢、霉菌、酵母菌保存6個月轉(zhuǎn)一次,普通細(xì)菌1個月轉(zhuǎn)一次,假單胞菌2周轉(zhuǎn)一次

  • 甘油凍存法:將復(fù)活后經(jīng)過性能確認(rèn)的菌株新鮮培養(yǎng)物(一般是第二代菌株),用0.85%的滅菌生理鹽水(約1-2ml)洗斜面菌苔成菌懸液;將上述菌懸液吸取適量于滅菌管(凍存管)中(如,滅菌管容量為5ml,則取1.5ml菌液),加入等體積的40%滅菌甘油,混勻,密封。保藏溫度為—20℃,一般可保存1-2年。

  • 瓷珠保存管保存:株保藏管內(nèi)含特制的小珠(20-25顆)和特殊溶液,只需將培養(yǎng)好的菌株接入溶液中,搖勻成菌懸液,細(xì)胞即吸附于小珠上,然后吸出溶液,將保藏管置-70℃可保存5年,置-20℃可保存2-3年。菌種保藏管




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