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水產(chǎn)養(yǎng)殖新突破:免疫磁珠分離-對流PCR技術助力弧菌快速檢測

發(fā)布時間:2025-04-30      瀏覽次數(shù):627    分享:

在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè),食品安全始終是公眾關注的焦點。其中,由致病性弧菌(Vibrio)引起的食源性疾病不僅對消費者健康構成威脅,還對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟造成了巨大損失。傳統(tǒng)的檢測方法往往耗時且靈敏度不足,難以滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。然而,最近一項研究開發(fā)出了一種結合免疫磁珠分離(IMBS)和對流PCR(CPCR)的新型檢測技術,為解決這一問題帶來了曙光。

技術背景與需求

弧菌是一類廣泛存在于水環(huán)境中的革蘭氏陰性細菌,其中一些種類如副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等具有致病性,能夠引發(fā)人類的腸胃炎、傷口感染等多種疾病。在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中,弧菌的污染尤為常見,尤其是在養(yǎng)殖水體、飼料以及水產(chǎn)品中。由于弧菌的多樣性和快速傳播能力,傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和PCR檢測方法在實際應用中存在諸多局限性。微生物培養(yǎng)耗時長,通常需要數(shù)天才能得到結果;而傳統(tǒng)PCR需要復雜的設備和專業(yè)人員操作,難以在現(xiàn)場快速應用。因此,開發(fā)一種快速、靈敏且適合現(xiàn)場使用的檢測技術迫在眉睫。

免疫磁珠分離-對流PCR技術的開發(fā)

最近,寧波大學的研究團隊開發(fā)了一種名為免疫磁珠分離-對流PCR(IMBS-CPCR)的新型檢測技術,專門用于現(xiàn)場快速檢測水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的四種致病性弧菌:溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)和哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。該技術的核心在于結合了IMBS和CPCR兩種先進技術。

CPCR是一種基于傳統(tǒng)PCR技術的改進方法,通過利用流體密度差實現(xiàn)反應物在冷熱區(qū)域之間的持續(xù)循環(huán),從而無需主動泵送即可完成核酸擴增。與傳統(tǒng)PCR相比,CPCR設備更加便攜,試劑消耗更少,且操作簡便,特別適合現(xiàn)場檢測。在本研究中,研究人員針對四種弧菌分別優(yōu)化了CPCR的退火溫度、延伸溫度、反應時間和引物濃度等條件,確保了檢測的準確性和靈敏度。

免疫磁珠條件優(yōu)化結果。(A)、(B)、(C) 分別代表抗原濃度、磁珠濃度和磁珠富集時間的優(yōu)化百分比

圖1 免疫磁珠條件優(yōu)化結果。(A)、(B)、(C) 分別代表抗原濃度、磁珠濃度和磁珠富集時間的優(yōu)化百分比。不同顏色代表四種不同的弧菌。點代表平均值,誤差線代表標準差。

免疫磁珠分離技術則是利用與磁性微球結合的特異性抗體,能夠高效地從復雜樣本中富集目標細菌。在本研究中,研究人員通過優(yōu)化抗體用量、磁珠濃度和捕獲時間等條件,實現(xiàn)了對目標弧菌的高效率捕獲,捕獲率高達82.6%至83.3%,而非目標細菌的捕獲率則低于11%。這一技術的優(yōu)勢在于其高特異性和高靈敏度,能夠在低濃度下檢測到目標細菌,最低檢測限可達10 CFU/mL。

免疫磁珠對靶標細菌和非靶標細菌的捕獲率

圖2 免疫磁珠對靶標細菌和非靶標細菌的捕獲率。細菌被分為兩組:靶標細菌(四種弧菌)和非靶標細菌。星號表示靶標細菌和非靶標細菌的捕獲率之間存在顯著差異(P<0.01)。所有實驗均重復三次,誤差線表示標準差。

技術優(yōu)勢與應用前景

IMBS-CPCR技術的結合,不僅提高了檢測的靈敏度和特異性,還大大縮短了檢測時間。與傳統(tǒng)的直接CPCR或PCR方法相比,該技術在模擬魚樣中的檢測靈敏度提高了10至100倍。此外,該技術還具有便攜性強、操作簡便、成本低等優(yōu)點,特別適合在水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)場、食品加工企業(yè)和海關等場所快速檢測弧菌污染。

在實際應用中,研究人員通過模擬魚樣實驗驗證了IMBS-CPCR技術的有效性。實驗結果表明,該技術能夠在低至101 CFU/mL的濃度下檢測到目標弧菌,且與傳統(tǒng)PCR的結果一致,證明了其準確性和可靠性。此外,該技術還能夠有效區(qū)分目標弧菌和其他非目標細菌,避免了誤報和漏報的可能性。

使用免疫磁珠分離 - 對流聚合酶鏈式反應(IMBS-CPCR)和免疫磁珠分離 - 聚合酶鏈式反應(IMBS-PCR)檢測四種弧菌的結果對比

圖3 使用免疫磁珠分離 - 對流聚合酶鏈式反應(IMBS-CPCR)和免疫磁珠分離 - 聚合酶鏈式反應(IMBS-PCR)檢測四種弧菌的結果對比。圖例顯示了四種弧菌的濃度,單位為 CFU/mL(菌落形成單位 / 毫升)。顏色的深淺代表在不同濃度下目標弧菌的富集能力。顏色越深,表明可檢測到的弧菌濃度越高,對應較低的靈敏度;反之,顏色越淺,表明可檢測到的弧菌濃度越低,對應較高的靈敏度。所有實驗均進行了三次重復。

結論與展望

IMBS-CPCR技術的開發(fā)為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的弧菌檢測提供了一種全新的解決方案。該技術結合了免疫磁珠分離的高特異性和對流PCR的快速檢測能力,具有顯著的現(xiàn)場應用優(yōu)勢。未來,隨著技術的進一步優(yōu)化和商業(yè)化推廣,IMBS-CPCR有望在更廣泛的食品安全檢測領域得到應用,為保障公眾健康和促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展發(fā)揮重要作用。

參考文獻:Zhang W, Yang Y, Kong F, et al. Development and optimization of immunomagnetic bead separation-convective PCR (IMBS-CPCR) for on-site detection of four common Vibrio species in aquaculture[J]. LWT, 2024, 211: 116928.

來源:微生物安全與健康網(wǎng),作者~蔡偉程。

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