在食品安全領(lǐng)域，病毒污染一直是全球關(guān)注的焦點(diǎn)。諾如病毒，作為一種極具傳染性的病原體，是導(dǎo)致全球約18%腹瀉病例的主要原因之一。它具有低感染劑量、快速發(fā)作和強(qiáng)大的傳播能力，給公共衛(wèi)生帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。然而，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法依賴(lài)于昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的操作流程，難以滿足快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。最近，一項(xiàng)結(jié)合了CRISPR技術(shù)與逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）的創(chuàng)新檢測(cè)方法，為這一難題帶來(lái)了新的解決方案。
諾如病毒：食品安全的重大威脅
諾如病毒是一種單股正鏈RNA病毒，屬于杯狀病毒科。其基因組包含三個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs），其中ORF1編碼六種非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2和ORF3分別編碼兩種結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2。該病毒在全球范圍內(nèi)廣泛分布，尤其在醫(yī)院、學(xué)校和郵輪等人員密集場(chǎng)所，一旦暴發(fā)，極易引發(fā)大規(guī)模感染。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅在美國(guó)，每年就有約2100萬(wàn)人感染諾如病毒，其中超過(guò)70000人需要住院治療，超過(guò)800人死亡。在中國(guó)，諾如病毒也是導(dǎo)致食源性疾病的重要因素之一，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。
傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性
目前，檢測(cè)諾如病毒的方法主要包括免疫學(xué)檢測(cè)、核酸擴(kuò)增技術(shù)（如PCR和qPCR）以及基因測(cè)序等。然而，這些方法存在一些局限性。免疫學(xué)方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但特異性差，對(duì)病毒變異適應(yīng)性弱，靈敏度低，易產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。qPCR雖靈敏度高，但設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，對(duì)溫度控制要求高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，難以在基層和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。此外，這些方法對(duì)食品基質(zhì)干擾敏感，成本較高，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求。這些局限性限制了傳統(tǒng)方法在實(shí)際應(yīng)用中的廣泛推廣，特別是在資源有限的地區(qū)。
CRISPR/Cas12技術(shù)：為病毒檢測(cè)帶來(lái)新曙光
CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列）技術(shù)近年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了重大突破，其在分子診斷中的應(yīng)用尤其引人注目。CRISPR/Cas系統(tǒng)由引導(dǎo)RNA（gRNA）、CRISPR相關(guān)蛋白（Cas蛋白）和目標(biāo)序列組成，當(dāng)gRNA與目標(biāo)序列匹配時(shí)，會(huì)激活Cas蛋白的切割活性，進(jìn)而產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。這種技術(shù)具有高度的特異性和靈敏度，能夠精準(zhǔn)識(shí)別目標(biāo)核酸序列，為病毒檢測(cè)提供了新的思路和方法。
在這項(xiàng)研究中，研究人員將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）技術(shù)與CRISPR/Cas12技術(shù)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出一種快速、靈敏的諾如病毒檢測(cè)方法。RT-LAMP技術(shù)能夠在較短時(shí)間內(nèi)完成核酸擴(kuò)增，而CRISPR/Cas12技術(shù)則進(jìn)一步提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度。這種組合方法不僅操作簡(jiǎn)便，而且對(duì)設(shè)備要求低，適合在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中應(yīng)用。
圖1 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）/ CRISPR/Cas12a 方法檢測(cè)諾如病毒（NOV）的示意圖。
檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)與創(chuàng)新
研究人員開(kāi)發(fā)的RT-LAMP/CRISPR Cas12a檢測(cè)系統(tǒng)具有多項(xiàng)顯著優(yōu)勢(shì)。首先，該系統(tǒng)僅需兩個(gè)反應(yīng)溫度，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在60分鐘內(nèi)完成，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。其次，該方法對(duì)不同食品基質(zhì)的干擾具有較強(qiáng)的抵抗力，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出被諾如病毒污染的食品樣本。此外，該檢測(cè)系統(tǒng)還具有較高的靈敏度和特異性，對(duì)于諾如病毒GI和GII的檢測(cè)靈敏度分別達(dá)到32.8拷貝/反應(yīng)和22.8拷貝/反應(yīng)。這意味著即使在病毒含量較低的情況下，也能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染，從而有效防止病毒的進(jìn)一步傳播。
圖2 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）/CRISPR/Cas12a 的特異性和靈敏度。所有數(shù)值均為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（SD），重復(fù)次數(shù)(n=6)。（a）諾如病毒（NOV）GI 型的檢測(cè)范圍；（b）NOV GII 型的檢測(cè)范圍；（c）NOV GI 型的特異性；（d）NOV GII 型的特異性。Fl 為熒光。
實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與應(yīng)用前景
為了驗(yàn)證該檢測(cè)方法的有效性，研究人員進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)。他們選擇了三種不同的食品樣本：生蔬菜、胡蘿卜和蛤蜊，并人為添加了已知濃度的諾如病毒RNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RT-LAMP/CRISPR Cas12a系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出所有陽(yáng)性樣本，且未在未污染的對(duì)照樣本中檢測(cè)到信號(hào)。這表明該方法具有較高的穩(wěn)定性和可靠性，能夠滿足實(shí)際檢測(cè)需求。
此外，該檢測(cè)系統(tǒng)還具有一定的通用性，通過(guò)簡(jiǎn)單更換引物和gRNA，可以針對(duì)其他核酸目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。這意味著該技術(shù)不僅可以用于諾如病毒的檢測(cè)，還可以擴(kuò)展到其他食源性病毒的檢測(cè)，為食品安全檢測(cè)提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具。
圖3 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）/ CRISPR/Cas12a 檢測(cè)人工污染食品樣本的結(jié)果。頂部為逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí) PCR（RT-qPCR）的 Ct 值，熱圖顯示熒光強(qiáng)度，底部為人工 RNA 靶標(biāo)的數(shù)量。（a）為諾如病毒（NOV）GI 型的檢測(cè)結(jié)果，（b）為 NOV GII 型的檢測(cè)結(jié)果。
未來(lái)展望
這項(xiàng)研究的成功不僅為諾如病毒的快速檢測(cè)提供了一種新的技術(shù)手段，也為其他食源性病毒的檢測(cè)開(kāi)辟了新的思路。通過(guò)簡(jiǎn)單地更換引物和crRNA，該檢測(cè)平臺(tái)可以輕松擴(kuò)展到其他病毒的檢測(cè)，具有很強(qiáng)的通用性和靈活性。此外，該方法還可以與小型化、便攜式的檢測(cè)設(shè)備結(jié)合，進(jìn)一步提高其在資源有限地區(qū)的應(yīng)用價(jià)值。
參考文獻(xiàn)：Gou S, Liu Y, Li Q, et al. CRISPR/Cas12‐mediated detection of GI and GII Norovirus in different food samples[J]. Journal of Food Science, 2025, 90(3): e70160.
來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。
