在食品、醫(yī)藥、可降解塑料等行業(yè)，L-乳酸扮演著關(guān)鍵角色。但傳統(tǒng)工藝需加入大量中和劑，不僅成本高，還帶來廢渣污染。乳酸作為一種關(guān)鍵的生物基化學(xué)原料，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品及可降解塑料（如聚乳酸PLA）等多個(gè)領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)微生物發(fā)酵在生產(chǎn)L-乳酸過程中，由于微生物對酸性環(huán)境耐受性差，乳酸積累會(huì)迅速導(dǎo)致pH下降，嚴(yán)重抑制微生物生長，影響發(fā)酵效率。為維持發(fā)酵平衡，通常需要大量添加中和劑如碳酸鈣，不僅提高生產(chǎn)成本，還伴隨副產(chǎn)物如硫酸鈣的生成，帶來環(huán)境與資源負(fù)擔(dān)。
近日，江南大學(xué)呂雪琴教授團(tuán)隊(duì)在《J. Agric. Food Chem.》發(fā)表研究成果，成功打造出全球首例在pH 2.6無中和劑條件下高效生產(chǎn)乳酸的釀酒酵母菌株，產(chǎn)量高達(dá)76.2 g/L，生產(chǎn)效率刷新紀(jì)錄！
圖1 文獻(xiàn)基本信息
圖2 圖形摘要
在本研究中，為實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)敲除與重組菌株構(gòu)建，作者首先利用攜帶Cas9表達(dá)框和sgRNA表達(dá)盒的PML104質(zhì)粒構(gòu)建了釀酒酵母的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，同時(shí)質(zhì)粒還包含用于篩選的尿嘧啶選擇標(biāo)記。在該系統(tǒng)中，sgRNA可指導(dǎo)Cas9蛋白在目標(biāo)DNA上產(chǎn)生雙鏈斷裂，隨后借助上下游長度為1000 bp的同源臂介導(dǎo)的同源重組機(jī)制完成靶基因的敲除或整合。三段所需的DNA片段均通過PCR擴(kuò)增獲得，并在設(shè)計(jì)時(shí)保留有50 bp的重疊序列，以促進(jìn)DNA片段的重組拼接。線性片段和質(zhì)粒以2∶1的比例共轉(zhuǎn)化入感受態(tài)釀酒酵母細(xì)胞，以構(gòu)建重組菌株。
為了提高酵母菌株對酸性環(huán)境的適應(yīng)能力，作者進(jìn)一步實(shí)施了適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化實(shí)驗(yàn)。在該過程中，以L-乳酸為選擇壓力，通過逐步調(diào)控酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基的pH值，實(shí)現(xiàn)對酵母菌株的選擇進(jìn)化。此外，為實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，作者對目標(biāo)基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。
圖3 篩選耐L-乳酸的釀酒酵母底盤菌株
圖4 乳酸脫氫酶的篩選
為評(píng)估重組釀酒酵母在不同發(fā)酵條件下生產(chǎn) L-乳酸的能力，作者首先在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。具體而言，預(yù)培養(yǎng)的酵母種子液在含 3 mL YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)約 20 小時(shí)后，接種至 250 mL 厭氧搖瓶中，每瓶含 40 mL YPD培養(yǎng)基，發(fā)酵過程在 30℃、220 rpm 條件下進(jìn)行 48 小時(shí)，并采用間歇葡萄糖補(bǔ)料以維持碳源供給。每個(gè)菌株均設(shè)置三個(gè)平行重復(fù)，以確保數(shù)據(jù)的可重復(fù)性與統(tǒng)計(jì)學(xué)穩(wěn)健性。進(jìn)一步地，為考察其在放大培養(yǎng)條件下的代謝性能，作者在 5 L 生物反應(yīng)器中進(jìn)行了規(guī)?；l(fā)酵。使用的發(fā)酵培養(yǎng)基中包含了大豆蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、KH?PO?、MgSO?、檸檬酸及微量金屬元素和維生素，以支持酵母細(xì)胞的生長和產(chǎn)酸能力。發(fā)酵過程在 30℃、200 rpm、厭氧環(huán)境下持續(xù)約 36 小時(shí)，并通過連續(xù)補(bǔ)料的方式將葡萄糖濃度維持在 5 g/L 左右，整個(gè)過程中未添加中和劑。
圖5 通過“推-拉-抑制”策略提高L-乳酸產(chǎn)量
圖6 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和輔因子工程進(jìn)一步提高L-乳酸滴度
為定量分析目的基因的表達(dá)水平，研究團(tuán)隊(duì)利用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）技術(shù)對關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了檢測?？俁NA提取采用市售RNA提取試劑盒完成，經(jīng)RT-PCR合成的cDNA用作熒光定量分析模板。qPCR反應(yīng)體系體積為 20 μL，使用 SYBR Premix Ex Taq 試劑，內(nèi)參基因?yàn)獒劸平湍?18S rDNA，實(shí)時(shí)熒光檢測則在 Roche LightCycler 480 II 系統(tǒng)上進(jìn)行。發(fā)酵產(chǎn)物中 L-乳酸的濃度通過高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行檢測。
本研究圍繞L-乳酸的綠色生物制造，構(gòu)建并優(yōu)化了多種工程化釀酒酵母菌株，實(shí)現(xiàn)了在無中和劑條件下的高效發(fā)酵生產(chǎn)。通過適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化，作者成功獲得了能夠耐受pH 2.60的工程菌株TMG2，為后續(xù)代謝通路的精準(zhǔn)重構(gòu)奠定了穩(wěn)定的底盤基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)篩選出高活性的乳酸脫氫酶LLDH，并進(jìn)一步引入“推—拉—抑制”代謝策略，實(shí)現(xiàn)了L-乳酸合成路徑的系統(tǒng)優(yōu)化，其中TMG16菌株的終產(chǎn)物滴度達(dá)到了46.8 g/L。
本研究的亮點(diǎn)在于整合長期適應(yīng)性進(jìn)化與多層次代謝工程手段，不僅顯著提高了菌株對強(qiáng)酸環(huán)境的適應(yīng)能力，也在無中和劑條件下大幅提升了L-乳酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，為綠色、可持續(xù)的生物制造提供了有效策略。該體系的建立對于減少傳統(tǒng)中和劑使用、降低生產(chǎn)成本和減緩環(huán)境負(fù)擔(dān)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
參考文獻(xiàn)：Baoyuan Guo, Wenwen Yu, Xianhao Xu, et al. Adaptively Evolved and Multiplexed Engineered Saccharomyces cerevisiae for Neutralizer-Free Production of L?Lactic Acid. ACS.jafc.4c12575.DOI:10.1021/acs.jafc.4c12575
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~趙瑾。
