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PCR 干粉引物溶解稀釋最佳方案

發(fā)布時間:2024-11-15    瀏覽次數:2206

現代科研基本離不開分子實驗,分子實驗又基本離不開PCR,PCR肯定離不開引物了,今天給小伙伴們介紹收到引物后的處理問題。

PCR干粉引物溶解稀釋的一般方法

01、收到引物后,在開啟離心管蓋前,在3000-4000轉/分鐘的轉速下離心1分鐘,以防開蓋時引物干粉散失。因為引物在干燥過程中,寡核苷酸在EP管底部形成白色片狀沉淀。鑒于運輸過程中沉淀會飄起,在打開管蓋之前進行簡短離心這一步驟至關重要。

02、引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。如果對實驗的重復性要求較高,合成的 OD 數較大,建議分裝,避免反復凍融。

03、引物一般配制成10-100μmol/L。

04、引物的濃度可以通過以下公式計算:
引物終濃度(μM)=所需引物量(μg)/引物分子量(g/mol)/反應體積(L)??梢愿鶕锏腛D值和分子量來計算需要加入多少液體才達到100μM的濃度,一般公司都會直接給算好,在標簽處標明需要加入多少液體溶解以達到100μM的濃度。

用哪種溶劑溶解引物?

如果需要稀釋引物,可以使用滅菌的去離子水或TE緩沖液(pH7.4-8.0)作為溶劑。其中,TE緩沖液比較穩(wěn)定,能提供穩(wěn)定的pH環(huán)境,適合于保存引物(以及質?;蚧蚪MDNA),但也有人認為,TE中的EDTA分子會影響后續(xù)PCR的效率。

引物的保存溫度和時間有什么限制?

未溶解的引物在-20℃下可保存至少1年,溶解后的引物在-20℃下避免反復凍融,可以保存至少半年以上。如果對實驗的重復性要求較高,合成的OD值較大,建議將溶解好的引物事先稀釋為100μmol/L的儲存液,分裝數份保存于-20℃冰箱。使用前,將濃溶液稀釋成工作液(10pmol/μL或20pmol/μL)后進行實驗。

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