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【新!】食品微生物檢驗(yàn)GB4789.2-2022菌落總數(shù)測(cè)定及注意事項(xiàng)

發(fā)布時(shí)間:2020-08-28      瀏覽次數(shù):38806    分享:

一、菌落總數(shù)定義和衛(wèi)生學(xué)意義

?菌落總數(shù)定義:指在一定條件下(如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等)每克(每毫升)檢樣所生長(zhǎng)出來的菌落數(shù)

?衛(wèi)生學(xué)意義:菌落總數(shù)測(cè)定是用來判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量,它反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求,以便對(duì)被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。


二、新標(biāo)準(zhǔn)概況

2022年06月30日發(fā)布     2022年12月30日實(shí)施


本標(biāo)準(zhǔn)與GB4789.2—2016相比,主要變化如下:
—— 增加了附錄B(菌落總數(shù)結(jié)果不同情況計(jì)算方法示例);
—— 修改了設(shè)備和材料;
—— 修改了培養(yǎng)基和試劑;
—— 修改了檢驗(yàn)程序;
—— 修改了操作步驟;
—— 修改了附錄 A(pca配方標(biāo)注主要營(yíng)養(yǎng)成分)。


三、修訂亮點(diǎn)

修訂亮點(diǎn):“增加菌落總數(shù)測(cè)試片”


四、HandyPlate測(cè)試片的質(zhì)量控制

HandyPlate測(cè)試片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)

?GB4789.28-2013 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求

附錄e

測(cè)試片使用步驟:
1、制備適宜濃度的測(cè)試菌液(可按GB4789.28自己制備,也可采用商品的定量菌株)


2、取1ml接種待測(cè)試測(cè)試菌片,另取1ml測(cè)試菌液傾注參比培養(yǎng)基TSA,按GB4789.28-2013附錄D中平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)上的培養(yǎng)條件進(jìn)行。


3、計(jì)數(shù)待測(cè)測(cè)試片上和參比培養(yǎng)基TSA上的菌落數(shù)(下圖為測(cè)試菌大腸埃希氏菌ATCC25922在菌落總數(shù)測(cè)試片和參比培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的結(jié)果)


4、計(jì)算測(cè)試菌在待測(cè)測(cè)試片上的回收率

選擇菌落數(shù)適中的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),按下列式(1)計(jì)算生長(zhǎng)率。

式中:
PR——生長(zhǎng)率;
NS——待測(cè)培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù);
N0——參比培養(yǎng)基平板上獲得的菌落總數(shù)。
參比培養(yǎng)基的選擇:一般細(xì)菌采用TSA,一般霉菌和酵母采用沙氏葡萄糖瓊脂,對(duì)營(yíng)養(yǎng)有特殊要求的微生物采用適合其生長(zhǎng)的不含抑菌劑或抗生素的培養(yǎng)基。
5、結(jié)果判定

依據(jù)GB4789.28-2013附錄D中平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)上質(zhì)控評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)各測(cè)試菌的生長(zhǎng)率≥0.7,如測(cè)試的測(cè)試片各測(cè)試菌生長(zhǎng)率≥0.7,則報(bào)告檢驗(yàn)合格,否則,為不合格。


五、其他變更情況

其他一般修訂內(nèi)容:

 2022版2016版
設(shè)備和材料恒溫裝置48℃±2℃恒溫水浴箱46 ℃±1 ℃
培養(yǎng)基和試劑4.3 無菌磷酸鹽緩沖液
4.4 無菌生理鹽水
4.2 磷酸鹽緩沖液
4.3 生理鹽水
檢驗(yàn)程序/操作步驟6.1.2 液體樣品稀釋補(bǔ)充“或放入盛有225ml稀釋液的無菌均質(zhì) 袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1:10的樣品勻液”
6.1.5選擇1~3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液,各取1mL分別加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)
6.1.6 及時(shí)將15mL~20mL冷卻至
46℃~50℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于48℃±2℃恒溫 裝置中保溫)傾注培養(yǎng)皿,并轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使其混合均勻。
/
2-3個(gè)適宜稀釋度
及時(shí)將15mL~20mL冷卻至46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于46 ℃±1 ℃恒溫水浴箱 中保溫)傾注平皿,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。
菌落計(jì)數(shù)/每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的 平均數(shù)。
菌落總數(shù)的報(bào)告/若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù),則報(bào)告菌落蔓延
附錄B新增:菌落總數(shù)結(jié)果不同情況計(jì)算方法示例”/


六、操作流程及注意事項(xiàng)

菌落總數(shù)檢驗(yàn)流程圖


操作注意事項(xiàng)
1:從樣品的均質(zhì)到傾注瓊脂,應(yīng)在盡快完成,避免影響結(jié)果;
2:檢驗(yàn)所用物品需無菌和無殘留的抑菌物質(zhì);
3:建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液,因?yàn)榱姿猁}緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化,對(duì)細(xì)菌具有保護(hù)作用;
4:高壓滅菌后,培養(yǎng)基的瓊脂會(huì)分層在底部,應(yīng)搖勻后使用;
5:在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),為防止中間平皿過熱,高度不得超過6個(gè)平皿。測(cè)試片堆疊不超20片


七、結(jié)果計(jì)算

1. 結(jié)果計(jì)數(shù)

?可用肉眼觀察,必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器,記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位(colony-formingunits,CFU)表示。 

?選取菌落數(shù)在30CFU~300CFU之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù),大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。

?其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí),則不宜采用,而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。

?當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)勢(shì),則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。

2. 結(jié)果計(jì)算


?若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在30~300CFU之間,計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值,再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),作為每g(mL)樣品中菌落總數(shù)結(jié)果,示例B1。

?若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU,則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),其他平板可記錄為多不可計(jì),結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算,示例B3。

?若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算,示例B4。

?若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長(zhǎng),則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算,示例B5。

?若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU~300CFU 之間,其中一部分小于30CFU 或大于300CFU 時(shí),則以最接近30CFU 或300CFU 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算,示例B6。

?若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí),按式(1)計(jì)算,示例B2

 

表1  菌落總數(shù)結(jié)果計(jì)算與報(bào)告方式實(shí)例

編號(hào)

稀釋倍數(shù)及菌落數(shù)

  

10-1

10-2

10-3

菌落總數(shù)

報(bào)告方式

平皿1

平皿2

平皿1

平皿2

平皿1

平皿2

(CFU/g或ml)

(CFU/g或ml)

1

0

0

0

0

0

0

﹤1×10

﹤10

2

24

26

5

7

0

0

250

250或2.5×102

3

多不可計(jì)

多不可計(jì)

150

160

15

20

15500

16000或1.6×104

4

多不可計(jì)

多不可計(jì)

236

245

35

33

24955

25000或2.5×104

5

多不可計(jì)

多不可計(jì)

236

245

25

33

24476

24000或2.4×104

6

多不可計(jì)

多不可計(jì)

多不可計(jì)

多不可計(jì)

320

330

325000

330000或3.3×105

7

多不可計(jì)

多不可計(jì)

310

320

28

26

27000

27000或2.7×104

8

多不可計(jì)

多不可計(jì)

295

325

22

20

29500

30000或3.0×104

9

菌落蔓延

菌落蔓延

菌落蔓延

菌落蔓延

菌落蔓延

菌落蔓延

菌落蔓延

菌落蔓延

3. 結(jié)果報(bào)告

?菌落數(shù)小于100CFU 時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報(bào)告。

?菌落數(shù)大于或等于100CFU 時(shí),第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。 

?若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù),則報(bào)告菌落蔓延。(已刪除)

?若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng),則此次檢測(cè)結(jié)果無效。

?稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告,體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。


八、質(zhì)量控制和疑難解析

1. 樣品處理時(shí)是否需調(diào)節(jié)pH?

 答:菌落總數(shù)大部分細(xì)菌都是嗜中性的,在偏酸偏堿的環(huán)境中都不適宜生長(zhǎng),如果樣品本身偏酸或偏堿,那接種后會(huì)改變平板瓊脂培養(yǎng)基的pH,從而影響樣品中大多數(shù)微生物的生長(zhǎng),影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2. 菌落蔓延怎么辦?

 答:首先需分析菌落蔓延的原因,一可能是樣品中含有運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)的細(xì)菌如:變形桿菌、芽孢桿菌等,二可能是傾注時(shí)瓊脂培養(yǎng)基溫度高,形成較多冷凝水,三可能是培養(yǎng)時(shí)沒有倒置,冷凝水滴落所致。

解決辦法:一、注意傾注培養(yǎng)基溫度控制在40-45度之間,避免冷凝水形成;二、培養(yǎng)時(shí)需倒置;三覆蓋一層培養(yǎng)基;四在培養(yǎng)基中添加ttc0.5%,三 、使用菌落總數(shù)測(cè)試片。

3. 菌落總數(shù)計(jì)數(shù)同一個(gè)稀釋度一個(gè)在計(jì)數(shù)范圍,一個(gè)不在計(jì)數(shù)范圍,怎么計(jì)?

 答:以在計(jì)數(shù)范圍的平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)作為報(bào)告結(jié)果。例如:某樣品10-1平板菌落數(shù)分別320、288,10-2稀釋度平板菌落數(shù)26、20,則樣品檢測(cè)結(jié)果選取288進(jìn)行報(bào)告,結(jié)果報(bào)告為2.9×10的3次方。

4. 平行兩個(gè)板結(jié)果相差較大?

 答:可能是樣液未完全混勻,導(dǎo)致菌落分布不均勻;或者取樣偏差較大,注意校準(zhǔn)取樣器具和取樣操作細(xì)節(jié)。平板間、稀釋度間菌落數(shù)誤差率不宜超10%。

5. 低稀釋度平板菌落數(shù)少于高稀釋度平板菌落數(shù)的原因是?

 答:一產(chǎn)品中含防腐劑或抑菌成分,二產(chǎn)品偏酸或偏堿。

6. 做菌落總數(shù)檢測(cè)時(shí),沒有菌落是怎么回事?

 答:一可能是樣品經(jīng)過滅菌處理,本身就沒有菌;二是檢測(cè)選擇的稀釋度過高;三樣品含抑菌成分未做去干擾處理;四傾注培養(yǎng)基溫度高或者培養(yǎng)條件不適宜等等。

7. 菌落總數(shù)的單位CFU與個(gè)有什么區(qū)別?

 答:CFU是菌落形成單位,單不等于細(xì)菌個(gè)數(shù),如兩個(gè)相同的細(xì)菌細(xì)胞連在一起,那經(jīng)過培養(yǎng)后這兩個(gè)細(xì)菌細(xì)胞將會(huì)形成一個(gè)菌落。

8. 如何保證檢測(cè)結(jié)果的有效性?

 答:一檢測(cè)過程需做空白對(duì)照,避免外源污染物影響;二檢驗(yàn)用培養(yǎng)基使用前需進(jìn)行質(zhì)量確認(rèn);三檢驗(yàn)過程所用器具經(jīng)檢定,操作規(guī)范減少誤差。

Q-Strain定量質(zhì)控菌株

 

九、所需培養(yǎng)基試劑和質(zhì)控菌株

 

用途

貨號(hào)

名稱

規(guī)格

樣品稀釋

CP0630

生理鹽水

盒(袋裝)225 mL×10袋

CP0511A

磷酸鹽緩沖液(PBS)

盒(瓶裝)225 mL×6瓶

CP0640

磷酸鹽緩沖液(PBS)

盒(袋裝)225 mL×10袋

022117

磷酸鹽緩沖液(PBS)

瓶(干粉)250 g

CP0310

生理鹽水

盒(管裝)9 mL×20支

平板計(jì)數(shù)

022070

平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)

瓶(干粉)250 g

CP0830

平板計(jì)數(shù)瓊脂平板(PCA)

盒(平板)90 mm×20

022070P1

平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)

瓶(顆粒)250 g

HANDYPLATE微生物測(cè)試片

HP001

菌落總數(shù)測(cè)試片

20片/包

Q-Strain定量質(zhì)控菌株

QS011A

大腸埃希氏菌(ATCC25922)

110-1100 CFU/瓶

QS011B

大腸埃希氏菌(ATCC25922)

(0.6-2.0)×107 CFU/瓶

QS008A

金黃色葡萄球菌(ATCC6538)

110-1100 CFU/瓶

QS008B

金黃色葡萄球菌(ATCC6538)

(0.6-2.0)×107 CFU/瓶

QS004A

枯草芽孢桿菌(CMCC(B) 63501)

110-1100 CFU/瓶

QS004B

枯草芽孢桿菌(CMCC(B) 63501)

(0.6-2.0)×107 CFU/瓶

 

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