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噬菌體的檢測(cè)及效價(jià)測(cè)定方法

發(fā)布時(shí)間:2014-06-23      瀏覽次數(shù):14787    分享:

噬菌體檢測(cè)原理

  噬菌體是一類(lèi)專(zhuān)性寄生于細(xì)菌和放線菌等微生物的病毒,其個(gè)體形態(tài)極其微小,用常規(guī)微生物計(jì)數(shù)法無(wú)法測(cè)得其數(shù)量。當(dāng)烈性噬菌體侵染細(xì)菌后會(huì)迅速引起敏感細(xì)菌裂解,釋放出大量子代噬菌體,然后它們?cè)贁U(kuò)散和侵染周?chē)?xì)胞,最終使含有敏感菌的懸液由混濁逐漸變清,或在含有敏感細(xì)菌的平板上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的空斑──噬菌斑。了解噬菌體的特性,快速檢查、分離,并進(jìn)行效價(jià)測(cè)定,對(duì)在生產(chǎn)和科研工作中防止噬菌體的污染具有重要作用。

  檢樣可以是發(fā)酵液、空氣、污水、土壤等(至于無(wú)法采樣而需檢查的對(duì)象,可以用無(wú)菌水浸濕的棉花涂拭表面作為檢查樣品)。為了易于分離可先經(jīng)增殖培養(yǎng),使樣品中的噬菌體數(shù)量增加。

  采用微生物檢測(cè)測(cè)定法進(jìn)行噬菌體檢測(cè),約需12h左右,因而不能及時(shí)判斷是否有噬菌體污染。通過(guò)快速檢測(cè)可大致確定是否有噬菌體污染,以采取必要的防治措施。根 據(jù)正常發(fā)酵(培養(yǎng))液離心后菌體沉淀,上清液蛋白含量很少,加熱后仍然清亮;而侵染有噬菌體的發(fā)酵(培養(yǎng))液經(jīng)離心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白,加熱后發(fā)生蛋白質(zhì)變性,因而在光線照射下出現(xiàn)丁達(dá)爾效應(yīng)而不清亮。此法簡(jiǎn)單、快速,對(duì)發(fā)酵液污染噬菌體的判斷亦較準(zhǔn)確。但不適于溶源性細(xì)菌及溫合噬菌體的診斷,對(duì)侵染噬菌體較少的一級(jí)種子培養(yǎng)液也往往不適用。

  噬菌體的效價(jià)即1mL樣品中所含侵染性噬菌體的粒子數(shù)。效價(jià)的測(cè)定一般采用雙層瓊脂平板法。由于在含有特異宿主細(xì)菌的瓊脂平板上,一般一個(gè)噬菌體產(chǎn)生一個(gè) 噬菌斑,故可根據(jù)一定體積的噬菌體培養(yǎng)液所出現(xiàn)的噬菌斑數(shù),計(jì)算出噬菌體的效價(jià)。此法所形成的噬菌斑的形態(tài)、大小較一致,且清晰度高,故計(jì)數(shù)比較準(zhǔn)確,因而被廣泛應(yīng)用。

檢測(cè)材料1.菌種

  敏感指示菌(大腸桿菌)、大腸桿菌噬菌體(從陰溝或糞池污水中分離)

2.培養(yǎng)基

  兩倍肉膏蛋白胨培養(yǎng)液,上層肉膏蛋白胨半固體瓊脂培養(yǎng)基(含瓊脂0.7%,試管分裝,每管mL),下層肉膏蛋白胨固體瓊脂培養(yǎng)基(含瓊脂2%),1%蛋白胨水培養(yǎng)基。

3.儀器耗材

  無(wú)菌的試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、移液管(1、5mL),恒溫水浴鍋,離心機(jī)、721分光光度計(jì)等。

噬菌體檢測(cè)方法1.噬菌體的檢測(cè)

  ①樣品采集

  將2~3g土樣或5mL水樣(如陰溝污水)放入滅菌三角瓶中,加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的敏感指示菌(大腸桿菌)菌液3~5mL,再加20mL二倍肉湯蛋白胨培養(yǎng)液。

  ②增殖培養(yǎng)

  30℃振蕩培養(yǎng)12~18h, 使噬菌體增殖。

  ③離心分離

  將上述培養(yǎng)液以3000rpm離心15~20min,取上清液,用pH7.0,1%蛋白胨水稀釋至10-2~10-3,用于噬菌體檢查及效價(jià)測(cè)定。

  ④生物測(cè)定法

雙層瓊脂平板法

  倒下層瓊脂,融化下層培養(yǎng)基,倒平板(約10mL/皿)待用。

  倒上層瓊脂

  融化上層培養(yǎng)基,待融化的上層培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí),每管中加入敏感指示菌 (大腸桿菌) 菌液0.2mL,待檢樣品液或上述噬菌體增殖液0.2~0.5mL,混合后立即倒入上層平板鋪平。

  恒溫培養(yǎng):30℃恒溫培養(yǎng)6~12h觀察結(jié)果。

  觀察結(jié)果:如有噬菌體,則在雙層培養(yǎng)基的上層出現(xiàn)透亮無(wú)菌圓形空斑噬菌斑。

單層瓊脂平板法

  省略下層培養(yǎng)基,將上層培養(yǎng)基的瓊脂量增加至2%,融化后冷卻至45℃左右,如同上法加入指示菌和檢樣,混合后迅速倒平板。30℃恒溫培養(yǎng)6~16h后觀察結(jié)果。

  ⑤離心分離加熱法(快速檢查)

  取大腸桿菌正常培養(yǎng)液和侵染有噬菌體的異常大腸桿菌培養(yǎng)液,4000rpm離心20min,分別取兩組發(fā)酵液的上清液(A1),一部分于721分光光度計(jì)上測(cè)定OD650光密度值,另外各取5mL上清液于試管中,置水浴中煮沸2min(A2),檢測(cè)A2溶液OD650光密度值,記錄結(jié)果。

2.噬菌體效價(jià)的測(cè)定

  ① 倒平板

  將融化后冷卻到45℃左右的下層肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基傾倒于11個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中,每皿約傾注10mL培養(yǎng)基,平放,待冷凝后在培養(yǎng)皿底部注明噬菌體稀釋度。

  ② 稀釋噬菌體

  按10倍稀釋法,吸取0.5mL大腸桿菌噬菌體,注入一支裝有4.5mL1%蛋白胨水的試管中,即稀釋到10-1,依次稀釋到10-6稀釋度。

3.噬菌體與菌液混合

  將11支滅菌空試管分別標(biāo)記10 -4、10 -5、10 -6和對(duì)照。分別從10 -4、10 -5和10 -6噬菌體稀釋液中吸取0.1mL于上述編號(hào)的無(wú)菌試管 中,每個(gè)稀釋度平行做三個(gè)管,在另外兩支對(duì)照管中加0.1mL無(wú)菌水,并分別于各管中加入0.2mL大腸桿菌菌懸液,振蕩試管使菌液與噬菌體液混合均勻, 置37℃水浴中保溫5min,讓噬菌體粒子充分吸附并侵入菌體細(xì)胞。

4.接種上層平板

  將11支融化并保溫于45℃的上層肉膏蛋白胨半固體瓊脂培養(yǎng)基5mL分別加入到含有噬菌體和敏感菌液的混合管中,迅速搓勻,立即倒入相應(yīng)編號(hào)的底層培養(yǎng)基平板表面,邊倒入邊搖動(dòng)平板使其迅速地鋪展表面。水平靜置,凝固后置37℃培養(yǎng)。

5.觀察并計(jì)數(shù)

  觀察平板中的噬菌斑,并將結(jié)果記錄于 計(jì)算公式:N=Y/V%×X

  (N:效價(jià)值,Y:平均噬菌斑數(shù)/皿,V:取樣量,X:稀釋度)

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